Análise microbiológica de sementes de plantas nativas da Caatinga
Importância da sanidade de sementes
A qualidade das sementes é determinada pelos fatores físicos, fisiológicos e sanitários que afetam a capacidade de realizar suas funções vitais, como a germinação, vigor e produtividade (POPINIGIS, 1985).
As atividades de produção de mudas de espécies florestais são de fundamental importância no processo produtivo do setor florestal. No entanto, apresenta algumas dificuldades na produção que podem comprometê-la. Entre os mais importantes são os de origem sanitária, devido à quantidade de patógenos associados às sementes e as mudas originadas destas (MUNIZ et al., 2007).
Condições insatisfatórias da sanidade de sementes contribuem de forma negativa na qualidade da semente, afetando negativamente as espécies no campo, além de prejudicarem a germinação, vigor e a produtividade, podem causar doenças em plantas (FREITAS, 2005).
De acordo com Netto e Faiad (1995) é de suma importância a qualidade sanitária das sementes de espécies florestais, devido à melhor germinação, evitando a perda das sementes por deterioração, anormalidades e lesões em plântulas.
A associação entre microrganismos e sementes é um fator preocupante, principalmente em regiões onde as condições climáticas favorecem o desenvolvimento de patógenos (MACHADO, 2000). Os microrganismos atacam as sementes no campo, podendo também contaminar-se nos procedimentos de beneficiamento e colheita, afetando a germinação e a viabilidade das sementes, causando também o tombamento de plântulas recém-emergidas (CARNEIRO, 1995).
Os patógenos associados às sementes promovem redução da população de plantas, interferindo no vigor das mudas, causando epidemias (MENTEN, 1995). O “damping-off” ou tombamento de mudas, doença que pode correr devido o patógeno ser introduzido pela semente, tem grande importância pois causa a morte da plântula, reduzindo o estande de mudas (MENDES et al., 1998).
As análises sanitárias de sementes são de extrema importância na produção de mudas de espécies florestais. Ao conhecer os microrganismos associados às sementes de determinada espécie florestal, é possível realizar o controle destes e, evitar perdas diretas e indiretas no campo. Nas sementes florestais ainda existe um agravante, pois algumas espécies apresentam periodicidade na produção de sementes, por produzirem quantidades elevadas em um ano e reduzirem a produção no ano seguinte. Portanto, é necessário o estudo sobre os agentes e as consequências da contaminação por microrganismos (BRASIL, 2009).
Avaliação sanitária de sementes
As normas estabelecidas para as avaliações da qualidade sanitária de sementes de espécies florestais são prescritas pela RAS (regras para análises de sementes) (BRASIL, 1992).
Geralmente, tem sido indicada a assepsia de sementes de espécies florestais nativas do Brasil, utilizando o hipoclorito de sódio em concentrações de 1 a 2 % por dois minutos (FERRAZ; CALVI, 2010).
Os procedimentos mais utilizados em testes de sanidade de sementes são os métodos de papel de filtro chamado de blotter test, e o da incubação das sementes em meio de cultura BDA (batata-dextrose-ágar). Este meio nutritivo é eficaz, devido à capacidade de identificar a presença de hifas, corpos de frutificação e esporos que podem variar do local onde se encontram, seja no interior ou exterior das sementes. Já o método do papel de filtro é utilizado para todos os tipos de sementes, e sua vantagem é a de detectar todos os fungos possíveis (LUCCA FILHO, 2006).
Ocorrência e danos de fungos em sementes de espécies nativas
As sementes de espécies nativas são contaminadas por diversos fungos patogênicos, não se sabe muito sobre os principais problemas que podem afetar as sementes. Com isso um estudo foi realizado com o intuito de avaliar a qualidade sanitária das sementes das espécies florestais Aroeira (Myracrodruon urundeuva Allemão), Cumarú (Amburana cearensis (Allemão) A.C. Smith), Jucá (Libidibia ferrea (Mart. Ex Tul.) L.P. Queiroz), Mororó (Bauhinia forficata Link), Mufumbo (Combretum leprosum Mart), Pereiro (Aspidosperma pyrifolium Mart) e Sabiá (Mimosa caesalpiniifolia Benth). A avaliação sanitária das sementes foi realizada através do método do papel de filtro (ARAÚJO et al., 2015).
De acordo com a avaliação sanitária, diversos gêneros de fungos foram encontrados associados às sementes, tais como: Alternaria, Ascotricha, Aspergillus, Cladosporium, Curvularia, Eurotium, Fusarium, Lasiodiplodia, Monodictys, Paecilomyces, Penicillium, Phoma, Phomopsis, Rhizopus e Rinocladiella. Os microrganismos Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Eurotium sp.1, Eurotium sp.2, Paecilomyces sp., Penicillium sp., Penicillium variabile e Rhizopus sp. foram classificados como fungos que contaminam a parte externa das sementes e as espécies de fungos Alternaria sp., Ascotricha sp., Cladosporium tenuissimum, Cladosporium oxysporum, Curvularia eragrostides, Fusarium solani, Fusarium subglutinans, Lasiodiplodia sp., Monodictys castanae., Phoma sp., Phopmopsis sp. e Rinocladiella sp. infectaram a parte interna das sementes. Muitos destes fungos desenvolvem-se em condições de armazenamento e de campo (ARAÚJO et al.,2015).
Foi realizado o levantamento qualitativo e quantitativo dos fungos presentes nas sementes de Mulungu (Erythrina velutina Willd.) após sete dias de incubação, foi realizado a análise das sementes utilizando microscópio estereoscópio e identificando pelas estruturas morfológicas dos fungos através do microscópio óptico (COUTINHO et al., 2007). Foi verificado nas sementes os fungos, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus spp., Penicillium spp., Rhyzopus sp., Cladosporium spp., Botritis sp. e Fusarium spp. Foi constatada a presença de fungos nas sementes mesmo após utilizarem fungicidas (OLIVEIRA et al., 2009).
Os microrganismos de armazenamento considerados como saprófitos, são classificados como oportunistas, pois em condições favoráveis invadem os tecidos das sementes com germinação afetando a viabilidade (OLIVEIRA et al., 2009). De acordo com estudos sobre a patologia de sementes de espécies florestais, obteve-se a ocorrência dos fungos, Aspergillus spp., Fusarium spp., Penicillium spp., Pestalotia sp. e Rhizopus sp. onde estes são responsáveis pela descoloração e redução da germinação de sementes (FAIAD et al., 2004).
Microrganismos em sementes de espécies florestais da Caatinga
Os microrganismos que se desenvolvem em sementes são identificados por meio da utilização de microscópio óptico, onde é possível visualizar as estruturas fúngicas como os micélios e esporos, de acordo com as descrições fitopatológicas (MENEZES; OLIVEIRA, 1993).
As sementes de espécies florestais contaminam-se predominantemente no solo onde os frutos e sementes são colonizados por diversos gêneros de fungos, como Fusarium, Alternaria, Phoma, Phomopsis, Rhizoctonia, Pythium e Cylindrocladium (FERREIRA, 1989).
Em trabalho desenvolvido por Botelho (2006), nas sementes de aroeira (Myracrodruon urundeuva), planta que ocorre frequentemente nas matas secas calcárias e na Caatinga arbórea (SANTOS et al., 2007), foram identificadas as espécies de fungos Alternaria alternata, Aspergillus sp., Penicillium sp., Drechslera sp., Cladosporium sp., Phoma sp. e Fusarium sp.
Mendes et al. (2005), relataram a ocorrência de Fusarium sp. e Pestalopioses sp. associados as sementes de sabiá (Mimosa caesalpiniaefolia) e, quando inoculados apresentaram-se patogênicos a esta espécie florestal. Também Araújo et al. (2007), quando trabalharam com sementes de sabiá detectaram os fungos dos seguintes gêneros: Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Rhizopus e Penicillium.
Várias espécies de fungos já foram relatadas em sementes de plantas florestais, incluindo espécies da Caatinga. Os gêneros mais encontrados foram Aspergillus, Curvularia, Fusarium, Mucor, Rhizopus e Trichoderma (MITTAR 1986). As sementes podem ser contaminadas internamente por fungos podendo reduzir a germinação e servir como inóculo para as doenças no campo (MACHADO, 1988).
Segundo Carvalho e Muchovej (1991), os fungos de sementes de espécies florestais podem ser saprófitas externos. Algumas espécies de fungos como Rhizopus stolonifer, Penicillium spp. e Aspergillus spp. são isolados de qualquer semente. A espécie R. stolonifer é preocupante quando manifesta-se em testes com sementes em laboratório, pelo seu desenvolvimento acelerado (CARVALHO e MUCHOVEJ, 1991), dificultando a identificação de outros.
Em ipê-roxo (Tabebuia impetiginosa) já foram encontrados os fungos Alternaria alternata e Phomopsis sp., ambos causadores de reduções na germinação e no desenvolvimento de plântulas (SALES, 1992).
Em pesquisa realizada por Vanzolini et al., (2010) foram identificados fungos patogênicos dos gêneros Alternaria, Macrophomina, Cladosporium, Colletotrichum, Fusarium, Phoma e Helminthosporium em sementes de pinhão-manso (Jatropha curcas). Neste trabalho, mesmo com a alta incidência de fungos, de diferentes gêneros, o lote de sementes de pinhão-manso apresentou elevada germinação e, os autores concluíram que os fungos exerceram pouca ou nenhuma intervenção sobre a germinação, apesar de serem fungos potencialmente patogênicos.
Benedito (2012) quando utilizou os métodos do papel-filtro e meio batata-dextrose-ágar (BDA), para avaliar a sanidade de sementes de Jurema-preta (Mimosa tenuiflora Willd.) identificaram os microrganismos Aspergillus niger, Penicillium sp., R. stolonifer e Rhizoctonia sp., embora apenas A. flavus tenha sido identificado no meio BDA. Na espécie Jurema-branca (Piptadenia stipulacea Benth.), também estudada por esta pesquisadora, foram encontrados os mesmos fungos, e Fusarium sp.
Importância dos fungos nas sementes
Diferentes gêneros de fungos apresentam importância em sementes devido aos problemas patológicos que podem apresentar nas sementes e mudas. O gênero Fusarium é geralmente relatado como responsável por tombamentos de pré ou pós-emergência em espécies florestais, tornando-se um problema quando presentes em sementes (FERREIRA, 1989).
O gênero Aspergillus é economicamente importante, mas algumas espécies são responsáveis por causar danos em várias plantas, sendo caracterizados como fungos oportunistas, dentre os patógenos mais comuns se encontram as espécies A. niger e A. flavus (VARGA et al., 2004). Para Perrone et al. (2007), as espécies mais comuns são: A. niger, A. flavus, A. parasiticus, A. ochraceus e A. alliaceus, pois contaminam em diferentes fases, como na pré-colheita, colheita, processamento, e manuseio, e são produtores de metabólitos secundários tóxicos.
O gênero Penicillium, é encontrado no solo, ar e em vegetações deterioradas, sendo identificado como patógeno oportunista de espécies de plantas. Algumas das espécies de Penicillium produzem micotoxinas, variando a importância destes compostos pelos fatores ecológicos e biológicos de cada espécie. P. citrionigrum e P. islandicum, são produtoras de toxinas potentes, porém como estas são raras, as toxinas que são produzidas não são consideradas de importância (PITT, 2000).
Os fungos Aspergillus e Penicillium afetam as sementes e são considerados fungos de armazenamento, causando apodrecimento de sementes, afetando a germinação e causando anormalidades em plântulas (MACHADO, 1988).
De acordo com Artigiani Filho e Bedendo (1995) fungos do gênero Drechslera foram encontrados em sementes de espécies florestais, como timbaúva, (CARNEIRO 1986; SANTOS et al. 2001) e em aroeira (MARTINS NETO et al., 1995).
No Brasil e na Venezuela foram identificadas algumas espécies de fungos no Trapiá. No Brasil, Mendes et al., (1998) detectaram Cercospora capparidicola e Resendea crataevae. Na Venezuela, foram encontradas as espécies Gonatophragmium mori, Pestalotiopsis pezizoides e Strigula elegans (URTIAGA, 2004).
Controle de microrganismos em sementes de espécies florestais da Caatinga
Para o controle de fungos em sementes, são empregados três tipos de tratamentos: químico, o qual consiste no uso de produtos químicos desenvolvidos para tal finalidade; físico, em que as sementes são expostas a ações térmicas controláveis ou outros agentes e biológico, em que há a incorporação de organismos antagonistas a fungos presentes nas sementes (MACHADO, 2000).
O tratamento de sementes é um método antigo e eficaz para o controle de doenças, de baixo custo, fácil aplicação agindo de forma direta na fonte de inóculo dos patógenos (MENTEN, 1995). Os tratamentos químicos e biológicos protegem as sementes e raízes de plântulas evitando a ação de patógenos (DHINGRA et al., 1980). O hipoclorito de sódio (NaClO), é geralmente utilizado para eliminar os contaminantes superficiais, controlando microrganismos patogênicos (COUTINHO et al., 2000).
A assepsia superficial das sementes é adotada antes da instalação do teste de sanidade, permitindo a identificação adequada dos microrganismos associados às sementes de espécies florestais, como as análises observadas da qualidade sanitária de sementes de canafístula (Pelptophorum dubium), maricá (Mimosa bimucronata) e timbaúva (Enterolobium contortisiliquum) (MUNIZ et al., 2007). No entanto, nem sempre a desinfestação das sementes com hipoclorito de sódio, na concentração adequada para não prejudicar a germinação, é suficiente para o controle de microrganismos patogênicos. Desta forma, é necessário a utilização de outras formas de controle para reduzir os problemas com doenças nas plantas.
Apesar de compostos químicos ainda serem os mais utilizados em tratamentos de sementes, o uso de organismos antagonistas e extratos vegetais como tratamento biológico é visto como um método alternativo ao uso de agroquímicos. O tratamento de sementes com microrganismos antagonistas pode proporcionar controle efetivo de fungos fitopatógenos presentes na superfície da semente e daqueles veiculados pelo solo. Exemplos de fungos antagonistas utilizados no controle biológico em sementes são os gêneros: Aspergillus spp., Chaetomium spp., Gliocladium spp. e Trichoderma spp. (BETTIOL; GHINI, 1995).
Foi realizado um estudo com a finalidade de testar as diferentes concentrações do óleo essencial de anis, com o objetivo de obter o controle dos microrganismos associados as sementes de erva-doce, as porcentagens de concentrações variadas que foram utilizadas no experimento proporcionaram um resultado de até 100% no controle do fungo Alternaria sp. Já o controle do fungo Cladosporium sp. foi obtido a partir de concentrações maiores (NETO et al., 2012).
Benedito (2012) quando trabalhou com jurema-preta e jurema-branca observou que o extrato de cravo nas concentrações de 1,5 a 2,0 %, inibiu em 100 % o crescimento dos fungos das espécies A. niger, A. flavus e Penicillium sp., observou também que para Fusarium sp. e Rhizoctonia sp., o extrato de cravo a 2,0 %, proporcionou resultados satisfatórios eliminando 100 % o crescimento destes microrganismos (BENEDITO, 2012).
O gênero Trichoderma sp. é muito utilizado no controle biológico de vários fungos patogênicos. Junges et al. (2016), avaliaram a utilização de Trichoderma spp. na produção de mudas das espécies florestais Pelptophorum dubium (Spreng.) Taub (canafístula), Parapiptadenia rigida (Benth.) Brenan (angico) e Cedrela fissilis Vell (cedro). Na avaliação da sanidade de sementes, a microbiolização com Trichoderma spp. se mostrou eficiente no controle de Fusarium sp. para espécies de canafístula, cedro e angico. Entretanto os melhores resultados foram obtidos em canafístula, onde Trichoderma, quando aplicado diretamente nas sementes proporcionou controle de patógenos associados e favoreceu a emergência e a produção de folhas nas mudas, apresentando potencial para ser usado no tratamento de sementes desta espécie.
O uso de extratos vegetais também é uma forma alternativa de controle de fungos em sementes de espécies florestais. Lazarotto et al. (2009) avaliaram extratos vegetais, Trichoderma e água quente para o controle de patógenos em sementes de cedro. Foram utilizados os extratos aquosos de boldo-brasileiro (Plectranthus barbatus), extrato aquoso de alho (Allium sativum) e controle biológico à base de Trichoderma spp. (250 g/100 kg de sementes) e água quente (50 °C por 30 minutos). Os tratamentos testados reduziram a incidência da maior parte dos patógenos associados às sementes de cedro. Entretanto, o tratamento que apresentou melhor resultado foi o extrato de alho onde foi possível controlar 100 % da incidência de A. niger. Além disso, esse tratamento não interferiu na germinação das sementes.
O controle físico também vem sendo adotado para reduzir a incidência de microrganismos em sementes de espécies florestais, Schneider et al., (2015), avaliaram a termoterapia na qualidade fisiológica e sanitária de sementes armazenadas de pinhão-manso. Os pesquisadores observaram que Aspergillus sp. foi controlado pela temperatura de 55 °C, através da termoterapia por imersão em água nos períodos de armazenamento de 180 e 270 dias.
A termoterapia consiste na exposição das sementes ao calor, seja úmido ou seco, em combinação com o tempo de ação do tratamento, objetivando a erradicação ou redução dos fitopatógenos. Apesar do eficiente controle de fitopatógenos em sementes, a termoterapia pode, se má conduzida, causar sérios danos à viabilidade das sementes, 11 devido ao rompimento de membranas e desnaturação proteica, assim como os tecidos de reserva, impossibilitando a germinação (MACHADO, 2000).
O controle químico é uma prática comum no tratamento de sementes e, diversos ingredientes ativos são registrados com esta finalidade. Entretanto, não existe registro de fungicidas recomendados para o tratamento de sementes de espécies florestais nativas (BOTELHO, 2006).
Porém, alguns trabalhos vêm sendo realizados com intuito de testar o efeito de fungicidas no controle de sementes de espécies florestais. Silvar et al. (2010), obtiveram resultados satisfatórios no controle de patógenos em sementes, observaram que em ipê-roxo, os fungicidas captan e tiram foram 100 % eficientes no controle de Fusarium sp. e Aspergillus sp. Já o pencicurom e hipoclorito de sódio foram eficientes na erradicação apenas de Aspergillus sp. Já para ipê-amarelo todos os tratamentos erradicaram o Aspergillus sp., entretanto, não houve controle do Fusarium sp. que apresentou alta incidência em todos os tratamentos.